Latar Belakang: Pemeriksaan glukosa darah puasa (GDP) merupakan salah satu metode penting dalam penegakan diagnosis dan pemantauan diabetes melitus. Prosedur ini mensyaratkan pasien untuk berpuasa selama 8–12 jam sebelum pengambilan sampel darah, guna memperoleh hasil yang akurat. Namun, praktik di lapangan menunjukkan adanya variasi durasi puasa yang melebihi 12 jam. Tujuan: Mengetahui perbedaan kadar glukosa darah puasa dengan lama puasa 8-12 jam dan lebih dari 12 jam. Metode: Penelitian ini adalah pre-experimental design dengan desain penelitian one group pretest posttest. Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2025. Populasi studi penelitian ini adalah mahasiswa Jurusan Teknologi Laboratorium Medis Angkatan 2024 Poltekkes Kemenkes Yogyakarta. Dengan jumlah sampel sebanyak 35 responden. Analisis data menggunakan uji Paired Simple Test. Hasil: Hasil penelitian ini menunjukan rata-rata kadar glukosa darah dengan lama puasa 8-12 jam 89.23 mg/dl dan lama puasa lebih dari 12 jam 80.69. berdasarkan hasil analisis data menggunakan uji Paired Simple Test menunjukan adanya perbedaan kadar glukosa darah dengan lama puasa 8-12 jam dan lebih dari 12 jam. Kesimpulan: Rerataan kadar glukosa darah pada lama puasa lebih dari 12 jam lebih rendah daripada lama puasa 8-12 jam. Kata Kunci: Kadar glukosa darah, Puasa