Latar Belakang: Deparafinisasi merupakan tahapan penting untuk menentukan keberhasilan proses pewarnaan hematoksilin eosin pada jaringan histologi yang bertujuan untuk menghilangkan residu parafin sebelum proses pewarnaan. Xylol merupakan agen deparafinisasi standar, namun memiliki toksisitas tinggi terhadap kesehatan dan lingkungan dalam jangka panjang. Minyak kelapa murni dapat dimanfaatkan sebagai alternatif agen deparafinisasi yang lebih aman bagi kesehatan, ramah lingkungan dan tidak merusak jaringan. Tujuan Penelitian: Untuk mengetahui gambaran hasil pewarnaan hematoksilin eosin pada jaringan kanker payudara yang dideparafinisasi menggunakan minyak kelapa murni sebagai agen deparafinisasi alternatif dibandingkan dengan xylol sebagai agen deparafinisasi standar. Metode Penelitian: Penelitian ini menggunakan pendekatan cross-sectional. Sampel berupa jaringan kanker payudara yang dibagi dalam tiga kelompok perlakuan: deparafinisasi menggunakan xylol, deparafinisasi menggunakan minyak kelapa murni dengan variasi suhu 50°C selama 10 menit dan suhu 60°C selama 8 menit. Hasil pewarnaan dievaluasi secara mikroskopis menggunakan parameter penilaian Ariyadi & Suryono (2017) berdasarkan kejelasan warna inti dan sitoplasma, keseragaman pewarnaan, serta kejernihan pewarnaan pada preparat menggunakan sistem skoring dan dianalisis secara deskriptif. Hasil Penelitian: Hasil pengamatan mikroskopis menunjukkan bahwa penggunaan minyak kelapa murni sebagai agen deparafinisasi pada suhu 50°C selama 10 menit dan suhu 60°C selama 8 menit menghasilkan pewarnaan yang baik dan setara dengan xylol. Seluruh preparat pada ketiga kelompok uji mendapatkan skor maksimal yang menunjukkan inti sel berwarna ungu serta sitoplasma berwarna merah muda tampak jelas dan kontras, kejernihan serta keseragaman pewarnaan tinggi dan merata. Kesimpulan: Penggunaan minyak kelapa murni sebagai agen deparafinisasi alternatif dengan pemanasan suhu 50°C selama 10 menit dan 60°C selama 8 menit pada pewarnaan hematoksilin eosin jaringan kanker payudara menunjukkan pewarnaan yang baik dan setara dengan xylol. Kata Kunci: Deparafinisasi, Xylol, Minyak Kelapa Murni, Pewarnaan Hematoksilin Eosin, Suhu, dan Waktu.