Latar Belakang: Faktor yang berpengaruh terhadap hasil pemeriksaan kolesterol salah satunya yaitu waktu inkubasi dan keterbatasan jumlah petugas. Mutu hasil pemeriksaan ditentukan dari banyak faktor, namun faktor ketepatan waktu inkubasi sampel juga dapat mempengaruhi kadar kolesterol yang dikeluarkan. Maka dari itu peneliti ingin melakukan penelitian terkait perbedaan hasil pemeriksaan kadar kolesterol yang diinkubasi selama 10 menit dan 90 menit pada suhu ruang. Tujuan: Mengetahui adanya perbedaan kadar kolesterol pada variasi inkubasi selama 10 menit dan 90 menit dengan suhu ruang menggunakan spektrometer. Metode: Penelitian ini merupakan jenis quasi-eksperimental menggunakan desain penelitian static group comparison design. Penelitian ini menggunakan 42 sampel serum. Masing-masing sampel dilakukan pemeriksaan dengan mengambil 1000 µl reagen kolesterol ditambahkan 10 µl sampel kemudian tiap sampel dilakukan inkubasi selama 10 menit dan diperpanjang 90 menit. Data yang diperoleh dilakukan analisis deskriptif dan analisis statistik menggunakan SPSS. Hasil: Hasil analisis deskriptif menunjukkan adanya penurunan hasil pemeriksaan rata-rata kadar kolesterol total yaitu dari 154,71 mg/dL pada inkubasi 10 menit menjadi 140,21 mg/dL pada inkubasi 90 menit. Penurunan ini sebesar 14,5 mg/dL (9,37%). Hasil analisis statistik uji wilcoxon menunjukkan nilai Asymp sig 0,000 sehingga dinyatakan bahwa adanya perbedaan yang signifikan terhadap hasil pemeriksaan kadar kolesterol total pada waktu inkubasi 10 menit dan inkubasi 90 menit. Kesimpulan: Ada perbedaan yang signifikan pemeriksaan kadar kolesterol total pada variasi inkubasi selama 10 menit dan 90 menit dengan suhu ruang menggunakan spektrometer. Kata Kunci: Kadar kolesterol total, Variasi inkubasi selama 10 menit dan 90 menit.