Latar Belakang : Bilirubin merupakan parameter penting dalam evaluasi fungsi hati dan diagnosis penyakit hemolitik. Namun, bilirubin bersifat tidak stabil dan mudah terdegradasi oleh cahaya dan suhu apabila terdapat keterlambatan dalam pengolahan sampel darah. Penundaan dalam tahap pra-analitik seperti sentrifugasi dapat memengaruhi akurasi kadar bilirubin total dalam serum. Tujuan Penelitian : Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi waktu penundaan sentrifugasi pada tabung Serum Separator Tube (SST) terhadap kadar bilirubin total. Metode : Penelitian ini merupakan pre-eksperimen dengan desain one group pretest-posttest. Sampel darah vena dari 8 responden diperiksa kadar bilirubin totalnya secara segera (kontrol), serta setelah penundaan sentrifugasi selama 1 jam, 2 jam, dan 4 jam. Pemeriksaan dilakukan menggunakan metode Jendrassik-Groff dengan spektrofotometer. Data diuji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk dan dianalisis menggunakan uji Repeated Measure ANOVA. Hasil : Rata-rata kadar bilirubin total mengalami penurunan bertahap seiring bertambahnya waktu penundaan, dari 1,1900 mg/dL (segera), menjadi 1,1325 mg/dL (1 jam), 1,0812 mg/dL (2 jam), dan 0,9825 mg/dL (4 jam). Penurunan tertinggi terjadi pada penundaan 4 jam dengan selisih 0,2075 mg/dL atau sebesar 17,44%. Hasil uji statistik menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara waktu penundaan terhadap kadar bilirubin total (p < 0,05). Kesimpulan : Terdapat pengaruh signifikan variasi waktu penundaan sentrifugasi terhadap kadar bilirubin total. Penundaan lebih dari 1 jam menyebabkan penurunan kadar yang bermakna dan dapat memengaruhi akurasi hasil pemeriksaan laboratorium. Disarankan agar proses sentrifugasi dilakukan sesegera mungkin setelah pengambilan darah, maksimal dalam waktu 1 jam. Kata Kunci : Bilirubin total, waktu penundaan, sentrifugasi, SST, pra-analitik