Latar Belakang: Pemeriksaan kadar kolesterol total adalah pemeriksaan untuk mengetahui kadar lemak dalam darah. Pemeriksaan kadar kolesterol menggunakan sampel serum. Penyimpanan sampel serum dilakukan karena terjadi penundaan pemeriksaan. Penyimpanan sampel serum yang tidak tepat dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan. Tujuan: Mengetahui ada perbedaan kadar kolesterol total pada serum segera diperiksa, disimpan pada suhu 2-8ºC dan disimpan beku di dalam freezer selama 3 hari. Metode: Jenis penelitian adalah pre-experimental design. Sampel pada penelitian sebanyak 30 dan dikelompokkan menjadi 3 perlakuan, yaitu segera, disimpan suhu 2-8ºC dan disimpan beku di dalam freezer. Data yang diperoleh dianalisis dengan uji statistik uji normalitas data dan uji friedman. Hasil: Hasil rerata kadar kolesterol total segera diperiksa dengan disimpan suhu 2-8ºC dan segera diperiksa dengan disimpan beku di dalam freezer selama 3 hari didapatkan selisih rata-rata secara berturut-turut adalah 22,13 mg/dl dan 1,7 mg/dl. Hasil uji statistic didapatkan nilai p = 0,000 yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan kadar kolesterol segera diperiksa dan disimpan selama 3 hari pada suhu 2-8ºC dan disimpan beku di dalam freezer. Kesimpulan: Terdapat perbedaan kadar kolesterol total pada serum yang segera diperiksa, disimpan pada suhu 2-8ºC dan disimpan beku di dalam freezer selama 3 hari. Kata Kunci: Kolesterol total, suhu, penyimpanan