ABSTRAK Latar Belakang: Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap hasil pemeriksaan kolesterol salah satunya yaitu, waktu inkubasi dan keterbatasan jumlah petugas. Mutu hasil pemeriksaan ditentukan dari banyak faktor, namun faktor ketepatan waktu pembacaan absorbansi juga dapat mempengaruhi kadar kolesterol yang dikeluarkan. Maka dari itu peneliti ingin melakukan penelitian terkait pembacaan absorbansi dengan variasi waktu untuk mengetahui perbedaan hasil pemeriksaan kadar kolesterol. Tujuan: Mengetahui pengaruh pembacaan absorbansi dengan variasi waktu inkubasi terhadap kadar kolesterol pada sampel hiperkolesterolemia dengan menggunakan metode CHOD-PAP. Metode: Penelitian ini adalah pre eksperimental dengan menggunakan rancangan One Group Pretest-Postest. Penelitian ini menggunakan 30 sampel serum hiperkolesterolemia. Masing-masing sampel dilakukan pemeriksaan dengan mengambil 10 µl samapel ditambahkan 1000 µl reagen kolesterol kemudian tiap sampel dilakukan inkubasi. Pembacaan absorbansi dilakukan sesuai variasi waktu yang sudah ditentukan yaitu 20 menit kemudian diperpanjang 10 menit, 50 menit dan 90 menit. Data yang diperoleh selanjutnya dilakukan analisis deskriptif dan analisis statistik menggunakan SPSS. Hasil: Analisis deskriptif menunjukkan adanya penurunan kadar kolesterol pada pembacaan absorbansi yang semakin lama. Uji Friedman test menunjukkan hasil adanya perbedaan kadar kolesterol pada pembacaan absorbansi dengan variasi waktu. Rerata hasil pembacaan absorbansi segera (20 menit), ditambah 10 menit, 50 menit dan 90 menit berturut-turut sebesar 259,97 mg/dl, 255,53 mg/dl, 253,97 mg/dl dan 248.60 mg/dl. Kesimpulan: Ada pengaruh pembacaan absorbansi dengan variasi waktu terhadap kadar kolesterol pada sampel hiperkolesterolemia. Kata Kunci: Variasi Waktu Pembacaan Absorbansi, CHOD-PAP, Hiperkolesterolemia