Latar Belakang: Pemeriksaan PPT (Plasma Prothrombin Time) merupakan pemeriksaan yang dilakukan sebelum tindakan operasi untuk mengetahui adanya riwayat perdarahan. Nilai PPT dipengaruhi oleh faktor praanalitik seperti urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% yang tidak tepat. Urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% berada pada urutan kedua baik dengan pemeriksaan penyerta ataupun tidak. Urutan pengisian tabung yang tidak tepat dapat menyebabkan gangguan dalam pengujian karena terjadi kontaminasi silang dari tromboplastin jaringan yang akan mengaktifkan jalur ekstrinsik. Tujuan Penelitian: Mengetahui perbedaan nilai PPT yang diperoleh dari pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% volume 2 ml pertama dan kedua. Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah penelitian survei (Survey Research Method) dengan potong silang (Cross Sectional). Rancangan ini berupa pemeriksaan pada kelompok uji yaitu pemeriksaan nilai PPT pada pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% volume 2 ml pertama dan kedua. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan statistic menggunakan uji Paired Sample T-Test. Hasil Penelitian: Selisih rerata dan presentase selisih rerata nilai PPT pada urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% volume 2 ml pertama dan kedua berturut-turut yaitu 1,2 detik dan 8,6%. Hasil uji Paired Sample T-Test menunjukkan signifikansi sebesar 0,000 (<0,05) dan nilai correlation (r) sebesar 0,00 (<0,05). Kesimpulan: Ada perbedaan nilai PPT (Plasma Prothrombin Time) yang diperoleh dari pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3,2% volume 2 ml pertama dan kedua. Kata Kunci: Urutan pengisian tabung, tromboplastin jaringan, Plasma Prothrombin Time