Latar Belakang: Antikoagulan Natrium Flourida (NaF) digunakan untuk mencegah glikolisis darah atau metabolisme glukosa dengan menghambat kerja enzim phosphoenol pyruvate dan urease sehingga dapat mempertahankan stabilitas kadar glukosa dalam sampel. Perbedaan antara serum dan plasma terjadi karena pada serum tidak terbentuknya fibrinogen dan beberapa faktor koagulasi lainnya sedangkan pada plasma masih mengandung semua fibrinogen dan bebrapa faktor koagulasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan kadar glukosa darah sewaktu menggunkan serum dan plasma NaF. Metode: jenis penelitian ini survei analitik dengan desain penelitian cross sectional dengan melakukan observasi atau pengukuran di Laboratorium Kimia Klinik Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Yogyakarta. Sampel penelitian ini sebanyak 15 sampel, jumlah sampel ditentukan dengan rumus Dahlan. Pengambilan sampel menggunakan teknik sampling secara simple random sampling. Sampel darah dibagi menjadi dua tabung untuk serum dengan tabung tanpa antikoagulan dan plasma dengan tabung dengan atikoagulan NaF. Pada tabung tanpa antikoagulan didiamkan hingga membeku selanjutnya dicentrifugasi. Sedangkan tabung dengan antikoagulan NaF dapat segera dicentifugasi selama 15 menit. Selanjutnya serum dan plasma NaF harus segera dipisahkan lalu dilanjut pemeriksaan dengan spektrofotometer. Hasil: Hasil penelitian menunjukan adanya perbedaan terhadap kadar glukosa darah sewaktu menggunakan serum dan plasma NaF dengan nilai rata-rata pada serum adalah 88,549 mg/dL serta nilai rata-rata pada plasma NaF adalah 103,884 mg/dL. Sedangkan hasil uji Independent t test memiliki nilai signifikan sebesar 0,000 (p ≤ 0,05) sehingga dapat diketahui bahwa terdapat perbedaan yang signifikan secara statistik antara hasil pemeriksaan kadar glukosa darah sewaktu menggunakan serum dan plasma Natrium Flourida (NaF). Kesimpulan: Ada perbedaan kadar glukosa darah sewaktu menggunakan serum dan plasma NaF. Kata kunci: Glukosa Darah, Serum, Plasma NaF