Abstrak Latar Belakang: Preparasi dalam pemisahan serum dari bekuan darah untuk pemeriksaan kadar protein total harus dilakukan dengan benar, karena serum yang diperoleh dari darah yang sudah didiamkan terlalu lama cenderung mengalami lisis sehingga dapat menyebabkan pelepasan hemoglobin dan protein seluler lain ke dalam serum. Terdapatnya sisa fibrinogen, faktor koagulasi dan protein seluler lain yang tidak termasuk protein serum dapat meningkatkan kadar protein total karena dapat ikut bereaksi dengan reagen protein total. Tujuan Penelitian: Mengetahui perbedaan kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit dan 120 menit sebelum disentrifus Metode Penelitian: Jenis penelitian yang digunakan adalah observasional analitik dengan desain penelitian cross sectional. Sampel penelitian berasal dari 20 mahasiswa Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Yogyakarta. Pengambilan darah menggunakan 2 buah tabung vakum tutup merah. Tabung vakum pertama didiamkan selama 30 menit dan tabung vakum kedua didiamkan selama 120 menit kemudian disentrifus. Data primer yang diperoleh kemudian dianalisis secara deskriptif dan statistik. Hasil Penelitian: Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit dan 120 menit sebelum disentrifus. Rata-rata kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit sebelum disentrifus sebesar 7,78 g/dL, sedangkan pada darah yang didiamkan 120 menit sebelum disentrifus sebesar 8,09 g/dL. Selisih rerata kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit dan 120 menit sebelum disentrifus adalah 0,31 g/dL. Nilai selisih rerata kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit dan 120 menit menunjukkan tidak berbeda secara signifikan (p=0,05). Kesimpulan: tidak ada perbedaan yang signifikan antara kadar protein total pada sampel darah yang didiamkan 30 menit dan 120 menit sebelum disentrifus Kata Kunci: Kadar protein total, sentrifus, pembuatan serum