Latar Belakang: Hemolisis merupakan salah satu penyebab utama kesalahan praanalitik yang dapat memengaruhi akurasi hasil pemeriksaan laboratorium, termasuk Aspartate Aminotransferase (AST). Penambahan reagen anti-Rh telah dilaporkan dapat mengurangi interferensi hemolisis pada beberapa parameter kimia klinik, namun pengaruhnya terhadap pemeriksaan AST belum diketahui. Tujuan: Mengetahui pengaruh penambahan anti-Rh pada serum hemolisis sedang terhadap aktivitas enzim Aspartate Aminotransferase (AST) serta mengetahui rerata aktivitas AST. Metode: Penelitian ini menggunakan desain quasi experimental dengan pendekatan post test only control group design. Sampel berupa darah vena dari 29 responden sehat yang memenuhi kriteria inklusi. Sampel dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu serum normal dengan penambahan NaCl 0,9%, serum hemolisis sedang dengan penambahan NaCl 0,9%, dan serum hemolisis sedang dengan penambahan anti-Rh. Pemeriksaan AST dilakukan menggunakan metode kinetik enzimatik IFCC pada panjang gelombang 340 nm. Analisis data menggunakan uji Friedman dan uji lanjut Wilcoxon Signed Rank Test. Hasil: Rerata aktivitas AST pada serum normal sebesar 9,09 U/L, serum hemolisis sedang sebesar 17,46 U/L, dan serum hemolisis sedang dengan penambahan anti-Rh sebesar 19,55 U/L. Uji Friedman menunjukkan adanya perbedaan bermakna antar kelompok (p=0.000), namun tidak terdapat perbedaan signifikan antara serum hemolisis sedang dengan dan tanpa penambahan anti-Rh (p=0.148). Kesimpulan: Penambahan anti-Rh belum efektif dalam menurunkan interferensi hemolisis pada pemeriksaan AST dan Aktivitas AST pada serum hemolisis sedang lebih tinggi dibandingkan serum normal. Kata kunci: Aspartate Aminotransferase (AST), Hemolisis sedang, Anti-Rh