Latar Belakang: Sitologi adalah ilmu yang mempelajari bentuk dan karakteristik sel dari jaringan tubuh, berperan penting dalam diagnosis awal seperti infeksi dan kanker. Pemeriksaan sitologi mukosa mulut, yang dilakukan melalui teknik eksfoliatif, memungkinkan deteksi dini gangguan seperti kanker mulut dengan cara yang cepat, mudah dan tidak invasif. Salah satu tahap penting dalam pemeriksaan ini adalah pewarnaan jaringan, di mana metode Papanicolaou digunakan untuk membedakan komponen sel berdasarkan muatan ionik menggunakan pewarna asam dan basa. Pewarna Orange G-6 yang memiliki afinitas terhadap komponen sitoplasma, diujikan dalam variasi waktu perendaman yang berbeda untuk mengetahui pengaruhnya terhadap kualitas pewarnaan. Tujuan Penelitian: Mengetahui pengaruh variasi waktu perendaman Orange G-6 selama 1, 3 dan 5 menit terhadap hasil pewarnaan papanicolaou pada mukosa mulut dan mengetahui waktu perendaman yang optimal. Metode Penelitian: Jenis penelitian menggunakan observasional deskriptif dengan desain penelitian eksperimental pendekatan cross sectional. Sampel yang digunakan 30 preparat mukosa mulut. Preparat kemudian dilakukan metode pewarnaan dengan pewarnaan papanicolaou. Data primer yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel skor, diagram batang dan analisis statistik. Hasil Penelitian: Pada variasi waktu perendaman Orange G-6 selama 1 dan 3 menit, menghasilkan kualitas sedang dengan sitoplasma berwarna ungu terlihat kurang jelas. Sedangkan pada variasi waktu 5 menit menghasilkan kualitas baik dengan sitoplasma berwarna ungu-merah muda terlihat jelas sehingga waktu optimal terjadi pada waktu 5 menit. Kesimpulan: Hasil penelitian menunjukkan adanya pengaruh variasi waktu perendaman Orange G-6 terhadap hasil pewarnaan papanicolaou pada mukosa mulut dengan waktu optimal terjadi pada variasi 5 menit. Kata kunci: Variasi Waktu, Pewarnaan Papanicolaou, Orange G-6, Mukosa Mulut