Latar Belakang: Pengaruh media dalam perkembangan bakteri sangat beragam dan bisa memberikan hasil yang berbeda terhadap pertumbuhan bekteri. Media MCA dan EMBA merupakan media spesifik dan diferensial untuk pertumbuhan bakteri Escherichia Coli. Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, fakultatif anaerob, dan non-spora yang menyebabkan diare. Tujuan: Mengetahui karakteristik morfologi, sel mikroskopis, rerata diameter, selisih rerata diameter, dan perbedaan signifikan koloni bakteri Escherechia coli pada media MCA dan EMBA yang inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Metode Penelitian: Eksperimen dilakukan dengan True Experimental Design dan Factorial experimental design. Subjek penelitian bakteri Escherechia coli yang ditumbuhkan pada pada media MCA dan EMBA dengan pengulangan 30 kali. Pengamatan penelitian meliputi besar diameter dan karakteristik koloni. Pengukuran diameter dilakukan dengan jangka sorong. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan Independent Sampel T-Test. Hasil: Rerata hasil pengukuran rerata diameter pada media MCA dan EMBA adalah 2,8 mm dan 1,4 mm. Selisih rerata besar diameter kedua media adalah 1,4 mm. Karakteristik koloni pada media MCA adalah berbentuk iregular, memiliki diameter 1,5 – 4,5 mm, elevasi naik, permukaan koloni bergelombang, berwarna merah muda dengan tepian bergerigi, sedangkan pada Media EMBA adalah berbentuk bulat, memiliki diameter 1,1 – 2,0 mm, elevasi cembung, permukaan koloni halus atau smooth, warna hijau metalik dengan tepian rata. Kesimpulan: Ada perbedaan ukuran diameter koloni bakteri pada pada media MCA dan EMBA yang inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kata kunci: Escherechia coli, diameter koloni, karakteristik koloni, Mac Conkey Agar (MCA), Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)