Latar Belakang: Bifidobacterium merupakan bakteri asam laktat yang umum digunakan sebagai probiotik karena mampu menjaga keseimbangan mikrobiota usus dan memberikan manfaat kesehatan. Sarang lebah Apis dorsata berpotensi menjadi sumber alami Bifidobacterium yang belum banyak dieksplorasi. Identifikasi spesies Bifidobacterium secara molekuler diperlukan untuk memastikan keberadaan spesies tersebut secara akurat dan spesifik. Tujuan: Mengidentifikasi spesies Bifidobacterium dari isolat bakteri hasil skrining ketahanan terhadap pH rendah, garam empedu, serta penambahan mineral zink dan besi menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode: Penelitian ini merupakan studi deskriptif. Sampel berupa isolat bakteri dari sarang lebah Apis dorsata yang telah lolos skrining. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode fenol-kloroform. Reaksi PCR dilakukan dengan multiplex primer spesifik Bifidobacterium dan hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa. Hasil: Hasil elektroforesis menunjukkan keberhasilan amplifikasi DNA pada beberapa isolat. Teridentifikasi pita DNA spesifik dengan ukuran sesuai spesies target yaitu B. lactis (382 bp) dan B. adolescentis (1197 bp). Kesimpulan: Isolat sarang lebah Apis Dorsata mengandung B. lactis dan B. adolescentis. Kata Kunci: Bifidobacterium, PCR, multiplex, sarang lebah, Apis dorsata