Latar Belakang: Gangguan pencernaan seperti diare masih menjadi masalah kesehatan masyarakat yang serius dan resistensi antibiotik yang meningkat. Salah satu alternatif untuk mengatasi masalah ini adalah penggunaan probiotik alami seperti Bifidobacterium sp., yang diketahui memiliki kemampuan antimikroba dan meningkatkan kesehatan usus. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi Bifidobacterium sp. dari sarang lebah Apis dorsata, menguji ketahanannya terhadap pH asam, garam empedu, zink (ZnSO₄), zat besi (FeSO₄) serta menguji aktivitas antibakterinya terhadap Escherichia coli. Tujuan: Mengisolasi, Skrining ketahanan terhadap pH asam, garam empedu, zink, Fe serta menguji daya antibakteri bakteri Bifidobacterium sp. dari sarang lebah Apis dorsata. Metode: Penelitian ini merupakan penelitian pre-eksperimental dengan desain one- shot case study. Isolat diperoleh melalui inokulasi sarang lebah pada media selektif, kemudian diuji ketahanannya selama 1–4 jam dalam media dengan pH 3, garam empedu 0,3%, ZnSO₄ 0,5% dan FeSO₄ 0,5%. Uji antibakteri dilakukan menggunakan metode sumuran terhadap bakteri patogen E. coli. Hasil: Hasil menunjukkan kelima isolat Bifidobacterium sp. mampu bertahan dalam semua perlakuan dan tidak menghasilkan zona hambat terhadap E. coli. Kesimpulan: Bifidobacterium sp. dari sarang lebah Apis dorsata memiliki potensi sebagai probiotik lokal yang efektif dan dapat dikembangkan. Kata Kunci: Bifidobacterium sp., probiotik, antibakteri, sarang lebah, Escherichia coli.