Latar Belakang: Tingginya kadar kolesterol dalam tubuh seseorang dapat menyebabkan penyakit kardiovaskular sehingga pemeriksaan kadar kolesterol total rutin dilakukan. Pemeriksaan kadar kolesterol total menggunakan serum yang harus segera diperiksa. Penyimpanan serum yang tidak tepat akan mempengaruhi hasil pemeriksaan. Tujuan: Mengetahui serum yang disimpan dalam serum separator tube selama 7 hari pada suhu 2-8°C boleh digunakan untuk pemeriksaan kadar kolesterol total. Metode: Jenis penelitian ini adalah pra eksperimen. Sampel yang digunakan 40 sampel dan dibagi 2 perlakuan, yaitu segera diperiksa dan disimpan selama 7 hari pada suhu 2-8°C. Pengolahan data dilakukan dengan uji statistik Paired Sample T-test Hasil: Hasil uji deskriptif didapatkan nilai selisih rata-rata 12,4 mg/dL. Hasil uji statistik didapatkan nilai ρ = 0,000 yang artinya terdapat perbedaan rata-rata kadar kolesterol total yang diperiksa segera dan disimpan selama 7 hari pada suhu 2-8°C. Sedangkan nilai persen bias relative sampai dengan penyimpanan 7 hari masih masuk rentang nilai ± 10%. Kesimpulan: Terdapat perbedaan rata-rata kadar kolesterol total yang segera diperiksa dan disimpan selama 7 hari pada suhu 2-8°C. Namun perbedaan tersebut tidak bermakna secara klinis sehingga pada penyimpanan 7 hari pada suhu 2-8°C masih diperbolehkan untuk dilakukan pemeriksaan kadar kolesterol total. Kata kunci: Kolesterol Total, Penyimpanan, Suhu, Serum Separator Tube