ABSTRAK Latar Belakang: Tahap pra analitik merupakan tahap yang penting dan menyumbang 68% kesalahan di laboratorium. Presentase ini disebabkan oleh beberapa faktor salah satunya dibagian pengolahan sampel yaitu proses pembuatan serum yang tertunda karena berbagai alasan. Hal ini dapat mempengaruhi hasil dan menyebabkan hasil yang dikeluarkan tidak sesuai dengan keadaan sesungguhnya. Tujuan Penelitian: Mengetahui pengaruh lama penundaan pembuatan serum selama 30 menit, 90 menit, 120 menit terhadap kadar kolesterol. Metode Penelitian: Penelitian ini merupakan penelitian observasional analitik dengan desain penelitian Cross Sectional. Sampel yang digunakan berupa serum yang terdiri dari 3 kelompok penanganan yang berasal dari 30 responden. Pengolahan darah dilakukan dengan menggunakan 3 buah tabung tabung vacutainer tutup merah. Darah pada tabung pertama akan dilakukan penundaan pembuatan serumnya selama 30 menit, tabung kedua selama 90 menit, tabung ketiga selama 120 menit sebelum disentrifus. Data hasil pemeriksaan kolesterol dianalisis secara deskriptif berupa tabel dan diagram batang serta secara statistik menggunakan Uji Repeated Measure ANOVA pada SPSS 26.0 for Windows. Hasil: Hasil dari penelitian ini menunjukkan terjadinya penurunan kadar kolesterol pada sampel yang dilakukan penundaan pembuatan serum. Rata-rata kadar kolesterol pada sampel yang ditunda pembuatan serumnya selama 30 menit sebelum disentrifus adalah 134,47 mg/dL, 90 menit yaitu 129,80 mg/dL dan 120 menit yaitu 125,27 mg/dL. Kesimpulan: Ada pengaruh lama penundaan pembuatan serum selama 30 menit, 90 menit, 120 menit sebelum disentrifus terhadap penurunan kadar kolesterol. Kata Kunci: Penundaan pembuatan serum, serum, kadar kolesterol