Latar Belakang: Pemeriksaan Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) adalah pemeriksaan laboratorium yang dilakukan sebelum operasi atau pemantauan terapi antikoagulan yang bertujuan untuk menilai aktifitas faktor koagulasi jalur intrinsik dan jalur bersama. Salah satu hal yang harus diperhatikan dalam tahap pra-analitik pemeriksaan hemostasis adalah urutan pengisian tabung pada pengambilan darah. Pengisian tabung yang tidak sesuai dapat menyebabkan gangguan dalam pemeriksaan karena terjadi kontaminasi silang dari spesimen, tromboplastin jaringan atau mikroorganisme. Tujuan: Mengetahui perbedaan nilai APTT yang diperoleh dari pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan tabung dengan antikoagulan Natrium sitrat 3.2 % volume 2 ml urutan pertama dan kedua. Metode Penelitian: Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian survei (Survey Research Method) dengan desain penelitian potong silang (Cross Sectional). Sampel yang digunakan berasal dari 20 orang dan terdiri dari 2 kelompok. Kelompok pertama adalah urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3.2% volume 2 ml pertama dan kelompok kedua pengisisan tabung 2 ml kedua. Data hasil pemeriksaan APTT diperoleh 40 data, kemudian data dianalisis dengan uji Paired sample t-test menggunakan SPSS 26.0 for windows. Hasil Penelitian: Hasil penelitian menunjukkan ada perbedaan nilai rerata APTT urutan pengisian tabung pertama dan tabung kedua pada pengambilan darah sistem vacutainer yaitu sebesar 34 detik dan 32.7 detik. Analisis statistik menunjukkan nilai signifikansi p = 0.000, artinya ada pebedaan hasil pemeriksaan APTT pada pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3.2% volume 2 ml pertama dan kedua. Perbedaan nilai APTT pada tabung pertama dan kedua tidak bermakna secara klinis. Kesimpulan: Ada perbedaan nilai APTT pada pengambilan darah sistem vacutainer menggunakan urutan pengisian tabung Natrium sitrat 3.2% volume 2 ml pertama dan kedua Kata kunci: Activated Partial Thromboplastin Time, tabung pertama, pre analitik, hemostasis