Latar Belakang : Hemolisis merupakan keluarnya hemoglobin dan komponen eritrosit lainnya termasuk ion-ion ke dalam serum dan penyebab terbesar kesalahan pada tahap pra analitik. Hemolisis dapat terjadi secara in vitro maupun in vivo. Hemolisis mempengaruhi hasil pemeriksaan kimia darah sehingga peneliti ingin mengetahui adakah pengaruh hemolisis terhadap aktivitas enzim Alkaline Phosphatase (ALP). Tujuan Penelitian : Mengetahui pengaruh serum hemolisis yang dinyatakan dengan kadar hemoglobin terhadap hasil pemeriksaan aktivitas enzim ALP. Metode Penelitian : Jenis penelitian ini adalah eksperimen murni dengan desain penelitian Posttest Only with Control Group Design. Sampel berupa serum yang dibagi menjadi 1 kelompok kontrol dan 6 kelompok dengan perlakuan. Masing-masing kelompok dengan perlakuan ditambah dengan hemolisat sehingga diperoleh kadar haemoglobin berturut-turut sebagai berikut: 50 mg/dL, 100 mg/dL, 150 mg/dL, 200 mg/dL, 250 mg/dL dan 300 mg/dL dan masing-masing kelompok ditetapkan aktivitas enzim ALPnya. Hasil Penelitian : Penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan rerata hasil pemeriksaan aktivitas enzim ALP. Analisis statistik menunjukkan p (0,000) < 0,05, artinya ada pengaruh serum hemolisis yang mengandung hemoglobin. Kadar hemoglobin dalam serum dimulai dari 50 mg/dL sudah mempengaruhi hasil pemeriksaan aktivitas enzim ALP. Kesimpulan : Ada pengaruh serum hemolisis yang dinyatakan dengan kadar hemoglobin terhadap hasil pemeriksaan aktivitas enzim ALP dimulai dari kadar Hb 50 mg/dL. Kata Kunci : Hemolisis, kadar hemoglobin, enzim ALP.