ABSTRAK Latar Belakang : Metode peremajaan yang dilakukan secara berkala dengan cara memindahkan biakan mikroba dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru dapat berisiko terkontaminasi, sehingga untuk memperoleh kultur standar bakteri yang murni perlu dilakukan identifikasi. Peremajaan berkala tidak dianjurkan untuk penyimpanan jangka panjang sehingga dapat menggunakan teknik liofilisasi yang merupakan teknik penyimpanan kering beku (freeze drying) menggunakan lioprotektan. Membandingkan antara jumlah total bakteri sebelum dan setelah pengeringan beku dengan ALT dapat digunakan untuk uji ketahanan bakteri. Tujuan Penelitian : Diketahuinya gambaran ALT pada bakteri Staphylococcus Aureus ATCC 25923 sebelum dan sesudah diliofilisasi dan disimpan selama 30 hari pada suhu 4˚C. Metode Penelitian : Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan desain penelitian Crossectional. Subjek penelitian adalah Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang dibeli di Balai Laboratorium Kesehatan dan Kalibrasi Yogyakarta yang akan dilakukan perhitungan ALT sebelum maupun sesudah diliofilisasi dan disimpan selama 30 hari pada 4˚C. Hasil penelitian dianalisis secara deskriptif Hasil Penelitian :.Terdapat penurunan rerata ALT bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 sebelum dan sesudah diliofilisasi dan disimpan selama 30 hari pada suhu 4ºC dengan selisih rerata 3,3 × 106 CFU/ml. Kesimpulan : Terdapat penurunan Angka Lempeng Total (ALT) pada bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 sebelum dan sesudah diliofilisasi dan disimpan selama 30 hari pada suhu 4˚C dengan ALT sebelum diliofilisasi (8,5×106 CFU/ml) lebih tinggi dari ALT setelah diliofilisasi dan disimpan selama 30 hari pada suhu 4oC (5,2×106 CFU/ml). Kata Kunci : Liofilisasi, Bakteri, ALT