Latar Belakang: Leptospirosis merupakan penyakit zoonosis yang disebabkan oleh bakteri Leptospira interrogans. Serovar dari Leptospira interrogans berperan dalam patogenesis leptospirosis. Gen lipL32 adalah gen konservatif yang spesifik pada Leptospira patogenik dan menunjukkan variasi antar serovar, sedangkan gen 16S rRNA bersifat konservatif pada seluruh bakteri dan digunakan untuk identifikasi tingkat genus. Kombinasi kedua gen ini dalam multiplex PCR memungkinkan deteksi yang spesifik untuk konfirmasi leptospirosis sekaligus jenis serovar yang ada di Indonesia. Tujuan Penelitian: Merancang dan menganalisis pasangan primer spesifik untuk amplifikasi gen 16s rRNA dan lipL32 pada Leptospira interrogans secara in silico. Metode Penelitian: Penelitian ini menggunakan metode in silico dengan mengambil urutan gen 16s rRNA dan lipL32 dari GenBank NCBI. Data daerah konservatif dianalisis menggunakan MAFFT version 7 dan Unipro UGENE versi 52. Pasangan primer didapatkan melalui perancangan oleh Primer-BLAST serta dilakukan analisis struktur sekundernya menggunakan NetPrimer. Simulasi multiplex PCR secara in silico dilakukan menggunakan PrimerPooler. Uji similaritas primer dilakukan dengan menggunakan Nucleutide BLAST. Hasil Penelitian: Daerah konservatif masing-masing kelompok data berhasil diidentifikasi dan digunakan sebagai cetakan primer. Masing-masing kelompok data didapatkan 10 kandidat primer spesifik dari Primer-BLAST. Setelah dilakukan analisis struktur sekunder didapatkan Primer 3 Leptospira meyeri, Primer 4 Leptospira interrogans serovar Hardjo, Primer 8 Leptospira interrogans serovar Bataviae dan Primer 9 Leptospira interrogans serovar Pyrogenes sebagai primer terbaik. PrimerPooler menunjukkan nilai delta G terkecil yang terbentuk sebesar - 1,49 kcal/mol. Uji similaritas menunjukkan masing-masing primer memiliki spesifitas yang tinggi. Kesimpulan: Kombinasi pasangan Primer 3 Leptospira meyeri (F: 5’- CCTAAGATTGACGCTGAAACA-3’, R: 5’-CGTTTAGGGCGTGGATTAC-3’), Primer 4 Leptospira interrogans serovar Hardjo (F: 5’- CTTCCCTACGGATCTGTGAT-3’, R: 5’-CGGCAGGAATCCAAACATAG-3’), Primer 8 Leptospira interrogans serovar Bataviae (F: 5’- ACCAGGTGAAGTGAAAGGAT-3’, R: 5’-GCTCACACCTGGAATACCT-3’), Primer 9 Leptospira interrogans serovar Pyrogenes (F: 5’- TTCTGAGCGAGGACACAATC-3’, R: 5’-TACGAACTCCCATTTCAGCG-3’) teridentifikasi sebagai kombinasi yang bai