Latar Belakang : Hemolisis merupakan kesalahan praanalitik (53,2%) yang mengganggu pemeriksaan Alanine Aminotransferase (ALT) akibat pelepasan enzim intraseluler dan interferensi spektral hemoglobin bebas pada panjang gelombang 340 nm. Penambahan reagen anti-Rh berpotensi menjadi alternatif penanganan melalui aglutinasi fragmen membran eritrosit. Tujuan : Mengetahui pengaruh penambahan reagen anti-Rh pada serum hemolisis sedang terhadap aktivitas enzim ALT. Metode : Desain quasi experimental menggunakan 33 unit pooled sera pada tiga kelompok: serum normal, hemolisis sedang, dan hemolisis sedang ditambah anti-Rh. Hemolisis diinduksi in vitro dan diverifikasi dengan metode Harboe. Pemeriksaan ALT menggunakan metode kinetik IFCC (λ 340 nm). Analisis data menggunakan Repeated Measures ANOVA dan Pairwise Comparisons Hasil : Rerata ALT serum normal 23,05 U/L, meningkat signifikan pada serum hemolisis sedang (29,83 U/L). Penambahan anti-Rh sedikit menurunkan menjadi (28,35 U/L). Uji Repeated Measures ANOVA menunjukkan perbedaan bermakna antarketiga kelompok (p=0,001). Uji Pairwise Comparisons menunjukkan perbedaan tidak bermakna antara serum hemolisis sedang dengan serum penambahan anti-Rh (p=0,418). Kesimpulan : Penambahan anti-Rh hanya menurunkan aktivitas ALT secara parsial melalui pengurangan kekeruhan fragmen membran eritrosit, tetapi belum mampu mengembalikan hasil setara serum normal karena hemoglobin bebas tetap terlarut. Kata Kunci: Anti-Rh, Hemolisis Sedang, Alanine Aminotransferase (ALT), Praanalitik, Interferensi