Latar Belakang: Pemeriksaan mikroskopis merupakan metode utama dalam diagnosis malaria untuk mendeteksi parasit Plasmodium dalam darah. Kualitas hasil dipengaruhi oleh pewarnaan Giemsa, khususnya jenis pelarut yang digunakan. Buffer fosfat mampu menjaga kestabilan pH sehingga menghasilkan pewarnaan optimal, sedangkan aquadest sering digunakan sebagai alternatif karena mudah diperoleh meskipun tidak memiliki sistem penyangga pH. Tujuan: Mengetahui perbedaan hasil pengamatan jumlah Plasmodium pada preparat darah yang diwarnai Giemsa 3% dengan pelarut buffer fosfat dan aquadest. Metode: Penelitian eksperimental dengan desain Intact Group Comparison yang dilakukan di Puskesmas Gedongtengen Yogyakarta pada 02 Januari– 26 Maret 2026. Sampel berupa 32 preparat darah malaria, terdiri dari 16 menggunakan buffer fosfat dan 16 aquadest. Pengamatan dilakukan secara mikroskopis untuk menilai kualitas pewarnaan dan menghitung jumlah Plasmodium. Analisis menggunakan uji Shapiro-Wilk dan Mann- Whitney U. Hasil: Rata-rata jumlah Plasmodium pada pelarut buffer fosfat sebesar 4,673 dan aquadest 4,493 dengan selisih 4,0%. Uji statistik menunjukkan p < 0,05, yang berarti terdapat perbedaan. Buffer fosfat menghasilkan pewarnaan lebih jelas dan kontras dibandingkan aquadest. Kesimpulan: Terdapat perbedaan antara penggunaan buffer fosfat dan aquadest. Buffer fosfat lebih optimal, namun aquadest masih dapat digunakan sebagai alternatif. Hasil mendukung penggunaan buffer fosfat sebagai standar pemeriksaan malaria mikroskopis rutin. Kata Kunci: malaria, Plasmodium, pewarnaan Giemsa, konsentrasi, pelarut.