Latar Belakang: Bakteri Streptococcus pneumoniae merupakan bakteri fastidious yang memerlukan media dengan nutrisi kompleks dalam pertumbuhannya seperti media agar darah. Media ini umumnya menggunakan darah domba, namun ketersediaannya terbatas sehingga diperlukan alternatif seperti darah kuda yang memiliki nutrisi serupa. Tujuan: Mengetahui bahwa media agar darah kuda dapat digunakan sebagai media alternatif pengganti media agar darah domba pada bakteri Streptococcus pneumoniae. Metode: Penelitian ini menggunakan desain quasi experimental dengan pendekatan static-group comparison. Subjek penelitian bakteri Streptococcus pneumoniae yang ditumbuhkan pada media agar darah kuda dan domba dengan pengulangan masing-masing 15 kali. Pengamatan meliputi diameter koloni, karakteristik koloni serta sel bakteri. Analisis data menggunakan Independent Sample T-Test. Hasil: Koloni pada kedua media berbentuk bulat, berwarna putih keabuan, elevasi cekung, tepian rata, tekstur lunak dan terbentuk alfa hemolisis. Sel bakteri pada kedua media berwarna ungu, berbentuk diplococcus dan termasuk dalam Gram positif. Rerata hasil pengukuran diameter koloni pada media agar darah domba dan agar darah domba adalah 0,71 mm dan 0,70 mm dengan selisih rerata diameter koloni adalah 0,01 mm (1,42%). Efektivitas media agar darah kuda adalah 102% dinilai sangat efektif. Analisis statistik menunjukkan tidak ada perbedaan pertumbuhan bakteri Streptococcus pneumoniae pada media agar darah kuda dan domba. Kesimpulan: Tidak ada perbedaan pertumbuhan bakteri Streptococcus pneumoniae pada media agar darah kuda dan domba. Media agar darah kuda dapat menjadi media alternatif pengganti media agar darah domba dalam isolasi dan identifikasi bakteri Streptococcus pneumoniae. Kata Kunci: Streptococcus pneumoniae, agar darah kuda, agar darah domba