Latar Belakang: Laporan World Health Organization menunjukkan bahwa 23% pembuangan darah donor disebabkan oleh masa simpan yang habis (kedaluwarsa). Packed Red Cells (PRC) kedaluwarsa merupakan limbah medis B3 yang kaya akan nutrien seperti hemoglobin dan zat besi, namun belum dimanfaatkan secara optimal. Di sisi lain, penggunaan darah domba sebagai standar emas media kultur mikroba memerlukan biaya tinggi dan memiliki keterbatasan aksesibilitas di beberapa daerah. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi potensi penggunaan limbah PRC kedaluwarsa sebagai media kultur alternatif untuk pertumbuhan dan zona hemolisis bakteri Streptococcus agalactiae. Metode: Jenis penelitian ini adalah eksperimen semu (Quasi Experiment) dengan rancangan post-test only with control group. Media kontrol menggunakan Agar Darah Domba (ADD) dan kelompok perlakuan menggunakan Agar PRC Kedaluwarsa (APK). Suspensi bakteri disetarakan dengan standar McFarland 0,5, diencerkan hingga {10}^{-5}, dan ditanam menggunakan metode cawan sebar dengan 16 kali replikasi. Hasil: Hasil uji Independent Samples T-test menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan pada jumlah koloni antara ADD (5,93\times {10}^{7}CFU/mL) dan APK (5,61\times {10}^{7} CFU/mL) dengan nilai p=0,360 (p>0,05). Uji Mann-Whitney menunjukkan perbedaan signifikan pada diameter zona hemolisis (p=0,000), di mana APK menghasilkan zona lebih lebar (2,76 mm) dibandingkan ADD (2,48 mm). APK memiliki nilai efektivitas (Productivity Ratio) sebesar 94,6%, memenuhi standar ISO 11133:2020 (≥70%). Karakteristik morfologi koloni pada kedua media tampak identik. Kesimpulan: PRC kedaluwarsa efektif digunakan sebagai media kultur alternatif yang layak untuk pertumbuhan dan identifikasi sifat hemolitik Streptococcus agalactiae, sekaligus memberikan solusi ekonomis dalam pengelolaan limbah medis.