Latar Belakang: Bakteri Corynebacterium diphtheria atau C. diphtheria merupakan bakteri gram positif penyebab penyakit difteri yang merupakan salah satu penyakit mematikan terutama pada anak dan dewasa era pre-vaksin. Apabila tidak diobati dan kasus tidak mempunyai kekebalan, angka kematian sekitar 50%, sedangkan dengan terapi angka kematiannya 10%. Faktor virulensi utama Corynebacterium diphtheria yaitu toksigenisitas (kemampuan memproduksi toksin). Produksi toksin diatur seperangkat gen yang disebut gen tox/dtx (diphtheria toxin gene) dan diregulasi oleh gen dtxR (Diphtheria Toxin Repressor) yang dikatalis oleh besi (Fe). Alternatif pemeriksaan toksigenisitas C. diphtheriae dapat dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR), gen dtxR dapat digunakan sebagai marker deteksi C. diphtheriae karena gen ini terdapat pada C.diphtheriae yang bersifat toksigenik maupun nontoksigenik. Perancangan primer merupakan langkah awal untuk memperoleh primer yang dapat digunakan dalam amplifikasi DNA (Deoxyribonucleic Acid) dengan metode PCR. Suatu primer yang baik untuk amplifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan desain secara in silico Tujuan Penelitian: Merancang dan menganalisis pasangan primer spesifik untuk amplifikasi gen gen dtxR pada bakteri C. diphtheria dengan metode in silico Metode Penelitian: Penelitian ini dilakukan secara in silico dengan mengambil urutan gen dtxR dari database GenBank NCBI. Daerah konservatif diidentifikasi melalui proses alignment menggunakan MAFFT versi 7 dan Unipro UGENE versi 52. Perancangan pasangan primer dilakukan dengan Primer-BLAST, kemudian dianalisis struktur sekundernya menggunakan NetPrimer. Uji similaritas primer dilakukan menggunakan Nucleotide BLAST. Hasil Penelitian: Daerah konservatif gen dtxR berhasil diidentifikasi dan digunakan sebagai daerah cetakan primer. Perancangan primer menggunakan Primer-BLAST menghasilkan 10 kandidat pasangan primer spesifik. Analisis struktur sekunder menunjukkan hasil bervariasi dengan pasangan primer 4 dan pasangan primer 6 merupakan pasangan primer paling optimal. Uji similaritas menunjukkan pasangan primer 6 memiliki spesifisitas tinggi terhadap gen dtxR dan tidak menunjukkan kemiripan dengan organisme lain. Kesimpulan: Pasangan primer 8 (forward: 5'-TGTGCCTTCTCATCTGCCG-3', reverse: 5'-TATGCCTCAAGGTCGGTCG-3') teridentifikasi sebagai kandidat pasangan primer terbaik dengan spesifisitas tinggi dan struktur yang optimal untuk amplifikasi gen dtxR pada bakteri C. diphtheria. Kata Kunci: Bakteri C. diphtheria, gen dtxR, perancangan primer PCR.