Latar Belakang: Infertilitas memengaruhi sekitar 8–12% pasangan secara global, dengan faktor pria berkontribusi sekitar 50%. Penilaian morfologi sperma merupakan parameter penting dalam evaluasi fertilitas dan secara standar dilakukan menggunakan metode Papanicolaou berdasarkan Strict Criteria dari WHO. Praktik laboratorium dilapangan masih menggunakan metode alternatif seperti Diff-Quik dan Safranin–Kristal Violet. Tujuan: Mengetahui perbedaan hasil pemeriksaan morfologi spermatozoa pada metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik, dan Safranin–Kristal Violet. Metode: Penelitian observasional analitik dengan pendekatan komparatif dilakukan pada 17 sampel semen di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Setiap sampel dibuat tiga apusan dan diwarnai menggunakan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal Violet. Analisis data menggunakan uji Friedman dan uji lanjut Wilcoxon. Hasil: Terdapat perbedaan signifikan antar metode (p < 0,05). Diff-Quik menunjukkan morfologi normal lebih rendah dan cacat kepala lebih tinggi, sedangkan cacat leher dan ekor lebih rendah. Safranin–Kristal Violet menunjukkan hasil yang mendekati Papanicolaou pada morfologi normal dan cacat ekor (p > 0,05), tetapi kualitas pewarnaan tidak selalu konsisten. Kesimpulan: Diff-Quik menunjukkan pergeseran hasil dibandingkan Papanicolaou, sedangkan Safranin–Kristal Violet lebih mendekati metode standar tetapi masih memiliki keterbatasan teknis. Kata kunci: pemeriksaan morfologi spermatozoa, Papanicolaou, Diff-Quik, Safranin–Kristal Violet