Latar Belakang: Infeksi Hepatitis B Virus (HBV) merupakan penyebab utama kematian akibat penyakit hati, khususnya karsinoma hepatoseluler (HCC). Gen HBx yang bersifat onkogenik berperan penting dalam patogenesis HBV. Deteksi ekspesi gen ini melalui Polymerase Chain Reaction (PCR) sangat bergantung pada primer yang spesifik, namun di Indonesia belum tersedia rancangan primer untuk amplifikasi gen HBx guna mendukung diagnosis HCC. Tujuan Penelitian: Merancang dan menganalisis pasangan primer spesifik untuk amplifikasi gen HBx pada HBV dengan metode in silico. Metode Penelitian: Penelitian ini dilakukan secara in silico dengan mengambil urutan gen HBx dari database GenBank NCBI. Daerah konservatif diidentifikasi melalui proses alignment menggunakan MAFFT versi 7 dan Unipro UGENE versi 52. Perancangan pasangan primer dilakukan dengan Primer-BLAST, kemudian dianalisis struktur sekundernya menggunakan NetPrimer. Uji similaritas primer dilakukan menggunakan Nucleotide BLAST. Hasil Penelitian: Daerah konservatif gen HBx berhasil diidentifikasi dan digunakan sebagai daerah cetakan primer. Perancangan primer menggunakan Primer-BLAST menghasilkan 10 kandidat pasangan primer spesifik. Analisis struktur sekunder menunjukkan hasil bervariasi dengan pasangan primer 1 dan pasangan primer 8 merupakan pasangan primer paling optimal. Uji similaritas menunjukkan pasangan primer 8 memiliki spesifisitas tinggi terhadap gen HBx dan tidak menunjukkan kemiripan dengan organisme lain. Kesimpulan: Pasangan primer 8 (forward: 5’-TGTGCCTTCTCATCTGCCG-3’, reverse: 5’-TATGCCTCAAGGTCGGTCG-3’) teridentifikasi sebagai kandidat pasangan primer terbaik dengan spesifisitas tinggi dan struktur yang optimal untuk amplifikasi gen HBx pada HBV. Kata Kunci: gen HBx, Hepatitis B Virus, primer spesifik, PCR, in silico