Latar Belakang: Masalah kesehatan pencernaan masih menjadi perhatian global, terutama akibat meningkatnya kasus infeksi saluran cerna yang disebabkan oleh bakteri Escherichia coli, Salmonella, dsb. Salah satu alternatif untuk mengatasi permasalahan ini adalah dengan mengembangkan produk probiotik dari genus Bifidobacterium. Penggunaan bahan alami sebagai sumber probiotik masih terbatas dan memerlukan eksplorasi lebih lanjut. Sarang lebah Tetragonula laeviceps merupakan salah satu bahan alami yang jarang diteliti. Beberapa studi melaporkan bahwa sarang lebah ini mengandung bakteri asam laktat, terutama dari genus Bifidobacterium. Tujuan: Mengetahui Bifidobacterium sp dapat diisolasi pada media selektif, mengevaluasi ketahanannya terhadap pH asam (pH 3.0), garam empedu 0.3%, ZnSO4 0.5%, dan FeSO4 0.5% serta mengetahui aktivitas antibakterinya terhadap bakteri patogen. Metode: Penelitian ini berjenis pre-eksperimen dengan pendekatan one-shot case study. Isolat diperoleh dengan mengisolasi sarang lebah Tetragonula laeviceps pada media selektif. Isolat kemudian diuji ketahanannya terhadap pH asam (pH 3.0), garam empedu 0.3%, ZnSO₄ 0.5%, dan FeSO₄ 0.5% selama inkubasi 1 hingga 4 jam. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumuran terhadap bakteri Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan isolat BSA3 dan BSA5 memiliki ketahanan paling tinggi dibandingkan isolat lainnya pada setiap perlakuan. Namun demikian, kedua isolat tersebut resisten terhadap bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028. Kesimpulan: Kelima isolat Bifidobacterium sp. memiliki kemampuan bertahan terhadap pH asam, garam empedu, ZnSO4, dan FeSO4. Namun demikian, seluruh isolat resisten terhadap bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028. Kata Kunci: Probiotik, Bifidobacterium sp. , Tetragonula laeviceps, ZnSO4, FeSO4