Latar belakang: Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang dapat menimbulkan infeksi di luar sistem pencernaan. Kloramfenikol merupakan agen antimikroba berspektrum luas sehingga mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif, gram positif maupun bakteri anaerob. Berdasarkan sifat dan kemampuan tersebut, antibiotik kloramfenikol dipilih dalam pengobatan infeksi akibat E.coli. Sehingga diperlukan pengujian sensitivitas secara in vitro untuk menilai efektivitas antibiotik kloramfenikol dalam menghambat pertumbuhan bakteri E.coli dengan metode difusi sumuran dan cakram. Tujuan: Mengetahui perbedaan rerata diameter zona hambat antara metode difusi sumuran dan metode difusi cakram pada uji sensitivitas bakteri E. coli terhadap antibiotik kloramfenikol. Metode: Penelitian ini termasuk dalam jenis eksperimen murni yang menerapkan desain Posttest Only Control Design. Teknik pengujian yang digunakan terdiri dari teknik sumuran dan teknik cakram pada media Muller Hinton Agar yang telah ditanami bakteri E. coli. Antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 30 µg diuji dengan masing-masing teknik sebanyak 16 kali pengulangan. Jangka sorong digunakan untuk mengukur diameter zona hambat, dan data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif, analitik dan statistik. Hasil: Teknik sumuran menghasilkan rerata diameter zona hambat sebesar 22,7 mm, sedangkan teknik cakram menghasilkan rerata diameter 25,6 mm. Kedua teknik menunjukkan kemampuan menghambat pertumbuhan E. coli, namun teknik sumuran memberikan zona hambat yang lebih kecil dibandingkan teknik cakram. Kesimpulan: Ada perbedaan signifikan pada rerata diameter zona hambat yang dihasilkan antara teknik sumuran dan cakram, dengan teknik sumuran menunjukkan penghambatan yang lebih kecil dibandingkan teknik cakram pada pertumbuhan E. coli. Kata kunci: Escherichia coli, kloramfenikol, uji sensitivitas, metode difusi sumuran, metode difusi cakram.