Latar Belakang: Teknik kering beku merupakan teknik yang banyak digunakan untuk penyimpanan bakteri jangka panjang. Penggunaan serum kuda sebagai lioprotektan karena terdapat kadar albumin. Perhitungan Angka Lempeng Total (ALT) digunakan untuk mengetahui viabilitas bakteri. Pengamatan morfologi dan biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri. Tujuan: Mengetahui Angka Lempeng Total (ALT), morfologi dan biokimia dari liofilisat bakteri Bacillus subtilis sebelum dan sesudah disimpan selama 2 bulan pada suhu 4oC. Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah pretest posttest with control. Subjek yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis yang akan dihitung ALT sebelum dan sesudah penyimpanan selama 2 bulan pada suhu 4oC dan diamati morfologi secara makroskopis pada media Nutrient Agar Plate dan mikroskopis yang diwarnai dengan pewarnaan gram dan pewarnaan spora serta uji biokimia. Hasil Penelitian: Hasil penelitian dianalisis secara deskriptif. Pada uji viabilitas, didapatkan data rerata ALT liofilisat bakteri sebelum dan sesudah penyimpanan 2 bulan sebesar 2,9 x 109 CFU/ml dan 2,04 x 109 CFU/ml. Pada pengamatan morfologi dan biokimia didapatkan hasil liofilisat bakteri sebelum dan sesudah penyimpanan sama dengan kontrol bakteri Bacillus subtilis. Kesimpulan: Didapatkan hasil terjadi penurunan pada Angka Lempeng Total (ALT) setelah disimpan selama 2 bulan pada suhu 4oC. Kata Kunci: Angka Lempeng Total (ALT), liofilisasi, serum kuda, morfologi, biokimia, Bacillus subtilis